Логин
Издавно человек культивирует растения.
По началу простым отбором, после создал методы селекции. А сейчас появились методы генной инженерии.
читать дальше
Культурные растения и домашние животные появились довольно просто - человек сохранял для воссоздания потомста те организмы, которые ему больше всего нравятся.
Говоря о растениях - это те, которые дают больше всего урожая. Самые большие клубни картофеля, самые большие зерна, или зерна с растений, где больше всего зернышек сажались на будущий год. Это - самый простой метод традиционной селекции. И самый долгий.
Так растения растут выше-больше, но все другие критерии растения, не так необходимые человеку, терялись, в частности устойчивость к засухе, к засолению, к различным грибкам. Растения начинали больше болеть и гибнуть.
Что бы восстановить устойчивость растений человек скрещивал растения с ближайшим диким видом, устойчивыми культурными сортами, или - самое сложное - с далекими видами. метод гибридизации Гибриды часто теряли вкусовые и урожайные качества, но приобретали устойчивость. Или и теряли все нужное, и не приобретали желаемого. Метод до сих пор широко используется.
За последние сто лет появились и другие методы традиционной селекции, против который никто не возражает, это же не ГМО.
Самый простой из них - это мутагенез. Когда растения обрабатывают какими-либо мутагенными факторами. Это могут быть химические вещества, или разного вида излучения. В результате чего в растениях могут быть генные, хромосомные и геномные мутации.
Мутации, в общем, могут быть 3 разных типов - когда "что-то" вставляется, когда "что-то" перемещается в другое место, или когда "что-то" исчезает.
В генных мутациях это может быть влезший в последовательность гена лишний нуклеотид, сместивший рамку считывания, кусок гена может вырезаться и влезть в другой участок этого же гена, или в другой ген. Ну, или вырезаться и все.
В хромосомный - то же самое, но на уровне хромосомы - кусок, например, целое плечо хромосомы может просто исчезнуть.
В геномных мутациях речь идет о количестве хромосом - может быть 1 лишняя, или наоборот, исчезнуть ит.д.
Какие это будут мутации, где они будут, сколько их будет - неизвестно. Совершенно. Более того - генные мутации очень сложно поймать в таком случае. И если растение выросло с большим урожаем и устойчивое к грибкам, считается хорошим. А то, что изменения могут привести к ядовитости мало кого волновало по началу, хотя сейчас все такие растения проходят испытания на мышах.
Что такое ГМО? Какие методы? Для чего?
Я рассмотрю три самых популярных метода.
Метод ГМО, который дорогой, редко используемый и в основном для растений, которые плохо (или совсем не) восприимчивы к другим методам, но который любят показывать телевизионщики - это бомбордировка. А слово-то какое страшное. А как происхожит жутко, ууу! Берутся микро-частицы золота или платины, на них прикрепляются последовательности ДНК, и этими частичками золота бомбардируются растения, где последовательности ДНК случайно встраиваются в геном клетки.
Звучит страшно, но Саузерн-блотинг анализом можно узнать сколько было вставок, и где, потому что - в отличие от мутагенеза - структуру ДНК нарушает известная последовательность.
Этот метод в основном используется для "выключения" генов. Т.е. если в последовательность гена встраивается кусок, ген кодирует совершенно другой белок и со своей изначальной функцией не справляются. Это используется, что бы узнать, какой ген за что именно отвечает. А так же для различных опытов. Двойными мутантами называются растения, у которых выключено два гена.
Так же есть метод электропорации.
Клетки растений имеют мембрану и клеточную стенку. Протопластом называется клетка без клеточной стенки, только с мембраной. В мембране есть поры, через которые в нормальном состоянии чужеродные ДНК не попадают. Протопласты помешают в солевую ванночку и пускают небольшой ток. Поры клетки стоновяться больше (при большом токе клетку вовсе разорвет). Для бактерий так же используют тепловой шок - на несколько секунд помещают в горячую воду.
ДНК попадает в клетку через раскрытые поры, так же клетка сама хватает ДНК и после снятия шокового воздействия - "а вдруг поможет".
Обоими этими методами длинные цепочки - например ген целиком - крайне сложно загнать в клетку.
Существует третий, самый распространенный метод генной инженерии.
В природе существует агробактерия (агро - земля. Это бактерии в природе живущие в почве). Она через ранки на деревьях проникает в них, и заражает клетки деревьев, отчего те начинают синтезировать (производить) не то, что нужно им, а то, что нужно бактерии. На деревьях образуются большие опухоли, в которых комфортно живут бактерии.
Как происходит.
У бактерий ДНК - кольцевая. Так же есть множество небольших допольнительных ДНК - называются плазмиды. Плазмидная ДНК. Прижимаясь к растительной клетке бактерия прокалывает ее клеточную стенку и мембрану, и передает в нее часть плазмиды. Этот кусочек ДНК встраивается в хромосому, благодаря повторам на концах. Кусочек ДНК и кодирует необходимый для бактерии ген. Обычно она передает клетке несколько копий этого гена, что бы клетка его больше нарабатывала. Это происходит в природе уже веками.
Так же бактериям свойственно поглощать ДНК из среды вокруг - вдруг пригодится. А если не нужно - избавляется от него. И происходит так, что бактерия берет ген у одного растения, через горизонтальный перенос передает другим бактериям, и какая-то другая бактерия, вместе с геном, что бы была нужная опухоль, отдает растению ген другого растения. Вот вам и береза с геном от одуванчика. Просто ген одуванчика только в опухоли на березе, но все равно. И это делает природа, повторюсь, веками.
Что делает человек?
Человек просто вырезает ген бактерии, и вместо него вставляет ген интереса (целевой ген). И бактерия уже заражает клетки растений не геном, нужным бактерии - его уже нет, а геном, необходимым человеку.
Метод, по сравнению со всеми вышеописанными самый деликатный, самый точный. Ты точно знаешь что ты вставляешь. Ты легко можешь проверить куда и в каком количестве.
Растения, так же, как и бактерии, могут избавляться от ненужных им генов. А гены, которые вставляет человек часто "не нужны" растению. И что бы растение не избавилось от него, вместе с целевым геном вставляют ген устойчивости (обычно - к антибиотику). После чего сажают растения на антибиотики. Кто выжил - тот трансформант. Используют так же не ген устойчивости, а ген, по которому можно внешне отличить трансформированное растение от не трансформированного - например ген, что бы растение светилось в темноте. Нецелевые гены, помогающие отобраться трансформанты называются маркерными генами, или генами селекции (селекционные гены).
Самое интересное по телевизору.
ГМО плохо. ГМО запрещено. ГМО это страшно и жутко вредно.
Но по телевизору можно услышать о хороших растениях, полученных методом, изобретенным самой природой. Когда агробактерия, взятая из почвы, помогает селекционерам развить в растении нужные качества. Матушка природа делает так давно, и это безопастно.
Так же по телевизору вы не услышите о трансгенных растениях, Это же ГМО, это плохо! Вместо этого используются специальная маркерная селекция - когда растения специально помечаются, и селекционерам легче отобрать. Это обычная селекция, просто маркерная.
Ну... ну вы поняли...
Немного картинок из моего диплома
Электрофореграмма результатов ПЦР-анализа
В дипломе мы трансформировали несколько линий картофеля геном устойчивости к фитофторозу - это целевой ген.
Маркерным геном был ген GFP (green fluorescent protein) - ген флуорисценции, выделенный из медузы, и используемый оооооооочень часто в "маркерных растениях", создаваемые методом изобретенным самой природой х)
ПЦР-анализ. Выделяемая ДНК из растений содержит некоторое количество копий нужного гена. Что бы определить его наличие искуственно заставляют полимеразы синтезировать только этот ген. Полимераза - это фермент, удвояющий ДНК. Что бы начать делать свою работу, ей нужно "куда-то" сесть. В клетке есть специальные "затравки". В пробирке используются праймеры. Для определения наличия какого-либо гена используется 15-20 нуклеотидов с одного и с другого конца гена. Полимераза садится на праймер и делает ген. Его становится больше, больше, больше. Если праймеру некуда сесть (нет целевого гена в пробирке), реакция не идет.
После реакции получившуюся смесь разделяют в агарозном геле просто поместив этот гель в солевой раствор под напряжением. Более короткие кусочки "убегают" дальше от лунки, в которую была залита проба - им легче проникать между молекулами геля. Более длинные - "убегают" короче.
На рисунке "М" - это маркер. Смесь последовательностей известных длинн, с помощью которого можно примерно оценить длину соседних фрагментов.
"С-" - отрицательный контроль, для которого используется растение "дикий тип". (Дикий тип - это изначальное, нетрансформированное растение. Любое, как культурное, так и нет. Дикий вид - "некультурное" растение)
"С+" - положительный контроль, для которого используется плазмида.
Для ПЦР анализа использовались уже отобранные по селективному гену растения, и проверялись на наличие целевого гена. В данном случае у всех растений есть "полоса" нужного размера - значит все имеют встройку гена.
Электрофореграмма результатов Нозерн-гибридизации
Встройка гена не всегда означает его транскрипцию. Возможно, что ген есть, но молчит (молчащих генов в любом организме много, это может быть по многим причинам). Поэтому необходимо проверить его экспрессию.
Для этого выделяют из растений РНК и прогоняют на агарозном геле - левая часть картинки.
После чего к гелю прикладывают мембрану, на мембрану кладут бумажки, а низ геля помещают в раствор, и благодаря силам, которые поднимают воду вверх, смачивая бумаги на мембране РНК переносится с геля на мембрану, которая задерживает ее в себе, не давая уйти на бумажки. После этого радиактивной меткой, которая садится только на РНК целевого гена обрабатывают мембраны, и в итоге получается картинка как справа. Если есть пятно - значит целевой ген экспресируется. В данном случае это справедливо для всех растений. Можно по яркости пятен сравнить где гена экспресируется больше, в где меньше. Но очень приблизительно. (Для оценки количества экспресии генов используется метод ПЦР в реальном времени)
Экстракт пептидов
Когда трансгенные растения выросли, они должны были наработать пептиды, которые помогают им защищаться от фитофтороза и альтернариоза (Самые растространенные грибки, поражающие картофель)
На первой картинке - листья картофеля, растертые в жидком азоте и залитые экстрагирующей смесью.
На второй картинке - получившаяся и уже растаявшая смесь, но отцентрифузированная.
На третьей картинке виден белый осадок - это и есть экстракт пептидов.
фитофтороз
На картинках видно, как зооспоры выходят из зооспорангия (слева), и виден уже развитий мицелий гриба фитофтороза (черные полосы)
Влияние экстрагированного комплекса пептидов на зооспорангии фитофтороза
Как видно, зооспорангии не открывается, и зооспорыне выходят. Заражения грибом не может произойти.
Ну и в последующий опытах было показано, что трансгенные линии лучше дикого типа устойчивы к фитофторозу.
По началу простым отбором, после создал методы селекции. А сейчас появились методы генной инженерии.
читать дальше
Культурные растения и домашние животные появились довольно просто - человек сохранял для воссоздания потомста те организмы, которые ему больше всего нравятся.
Говоря о растениях - это те, которые дают больше всего урожая. Самые большие клубни картофеля, самые большие зерна, или зерна с растений, где больше всего зернышек сажались на будущий год. Это - самый простой метод традиционной селекции. И самый долгий.
Так растения растут выше-больше, но все другие критерии растения, не так необходимые человеку, терялись, в частности устойчивость к засухе, к засолению, к различным грибкам. Растения начинали больше болеть и гибнуть.
Что бы восстановить устойчивость растений человек скрещивал растения с ближайшим диким видом, устойчивыми культурными сортами, или - самое сложное - с далекими видами. метод гибридизации Гибриды часто теряли вкусовые и урожайные качества, но приобретали устойчивость. Или и теряли все нужное, и не приобретали желаемого. Метод до сих пор широко используется.
За последние сто лет появились и другие методы традиционной селекции, против который никто не возражает, это же не ГМО.
Самый простой из них - это мутагенез. Когда растения обрабатывают какими-либо мутагенными факторами. Это могут быть химические вещества, или разного вида излучения. В результате чего в растениях могут быть генные, хромосомные и геномные мутации.
Мутации, в общем, могут быть 3 разных типов - когда "что-то" вставляется, когда "что-то" перемещается в другое место, или когда "что-то" исчезает.
В генных мутациях это может быть влезший в последовательность гена лишний нуклеотид, сместивший рамку считывания, кусок гена может вырезаться и влезть в другой участок этого же гена, или в другой ген. Ну, или вырезаться и все.
В хромосомный - то же самое, но на уровне хромосомы - кусок, например, целое плечо хромосомы может просто исчезнуть.
В геномных мутациях речь идет о количестве хромосом - может быть 1 лишняя, или наоборот, исчезнуть ит.д.
Какие это будут мутации, где они будут, сколько их будет - неизвестно. Совершенно. Более того - генные мутации очень сложно поймать в таком случае. И если растение выросло с большим урожаем и устойчивое к грибкам, считается хорошим. А то, что изменения могут привести к ядовитости мало кого волновало по началу, хотя сейчас все такие растения проходят испытания на мышах.
Что такое ГМО? Какие методы? Для чего?
Я рассмотрю три самых популярных метода.
Метод ГМО, который дорогой, редко используемый и в основном для растений, которые плохо (или совсем не) восприимчивы к другим методам, но который любят показывать телевизионщики - это бомбордировка. А слово-то какое страшное. А как происхожит жутко, ууу! Берутся микро-частицы золота или платины, на них прикрепляются последовательности ДНК, и этими частичками золота бомбардируются растения, где последовательности ДНК случайно встраиваются в геном клетки.
Звучит страшно, но Саузерн-блотинг анализом можно узнать сколько было вставок, и где, потому что - в отличие от мутагенеза - структуру ДНК нарушает известная последовательность.
Этот метод в основном используется для "выключения" генов. Т.е. если в последовательность гена встраивается кусок, ген кодирует совершенно другой белок и со своей изначальной функцией не справляются. Это используется, что бы узнать, какой ген за что именно отвечает. А так же для различных опытов. Двойными мутантами называются растения, у которых выключено два гена.
Так же есть метод электропорации.
Клетки растений имеют мембрану и клеточную стенку. Протопластом называется клетка без клеточной стенки, только с мембраной. В мембране есть поры, через которые в нормальном состоянии чужеродные ДНК не попадают. Протопласты помешают в солевую ванночку и пускают небольшой ток. Поры клетки стоновяться больше (при большом токе клетку вовсе разорвет). Для бактерий так же используют тепловой шок - на несколько секунд помещают в горячую воду.
ДНК попадает в клетку через раскрытые поры, так же клетка сама хватает ДНК и после снятия шокового воздействия - "а вдруг поможет".
Обоими этими методами длинные цепочки - например ген целиком - крайне сложно загнать в клетку.
Существует третий, самый распространенный метод генной инженерии.
В природе существует агробактерия (агро - земля. Это бактерии в природе живущие в почве). Она через ранки на деревьях проникает в них, и заражает клетки деревьев, отчего те начинают синтезировать (производить) не то, что нужно им, а то, что нужно бактерии. На деревьях образуются большие опухоли, в которых комфортно живут бактерии.
Как происходит.
У бактерий ДНК - кольцевая. Так же есть множество небольших допольнительных ДНК - называются плазмиды. Плазмидная ДНК. Прижимаясь к растительной клетке бактерия прокалывает ее клеточную стенку и мембрану, и передает в нее часть плазмиды. Этот кусочек ДНК встраивается в хромосому, благодаря повторам на концах. Кусочек ДНК и кодирует необходимый для бактерии ген. Обычно она передает клетке несколько копий этого гена, что бы клетка его больше нарабатывала. Это происходит в природе уже веками.
Так же бактериям свойственно поглощать ДНК из среды вокруг - вдруг пригодится. А если не нужно - избавляется от него. И происходит так, что бактерия берет ген у одного растения, через горизонтальный перенос передает другим бактериям, и какая-то другая бактерия, вместе с геном, что бы была нужная опухоль, отдает растению ген другого растения. Вот вам и береза с геном от одуванчика. Просто ген одуванчика только в опухоли на березе, но все равно. И это делает природа, повторюсь, веками.
Что делает человек?
Человек просто вырезает ген бактерии, и вместо него вставляет ген интереса (целевой ген). И бактерия уже заражает клетки растений не геном, нужным бактерии - его уже нет, а геном, необходимым человеку.
Метод, по сравнению со всеми вышеописанными самый деликатный, самый точный. Ты точно знаешь что ты вставляешь. Ты легко можешь проверить куда и в каком количестве.
Растения, так же, как и бактерии, могут избавляться от ненужных им генов. А гены, которые вставляет человек часто "не нужны" растению. И что бы растение не избавилось от него, вместе с целевым геном вставляют ген устойчивости (обычно - к антибиотику). После чего сажают растения на антибиотики. Кто выжил - тот трансформант. Используют так же не ген устойчивости, а ген, по которому можно внешне отличить трансформированное растение от не трансформированного - например ген, что бы растение светилось в темноте. Нецелевые гены, помогающие отобраться трансформанты называются маркерными генами, или генами селекции (селекционные гены).
Самое интересное по телевизору.
ГМО плохо. ГМО запрещено. ГМО это страшно и жутко вредно.
Но по телевизору можно услышать о хороших растениях, полученных методом, изобретенным самой природой. Когда агробактерия, взятая из почвы, помогает селекционерам развить в растении нужные качества. Матушка природа делает так давно, и это безопастно.
Так же по телевизору вы не услышите о трансгенных растениях, Это же ГМО, это плохо! Вместо этого используются специальная маркерная селекция - когда растения специально помечаются, и селекционерам легче отобрать. Это обычная селекция, просто маркерная.
Ну... ну вы поняли...
Немного картинок из моего диплома
Электрофореграмма результатов ПЦР-анализа
В дипломе мы трансформировали несколько линий картофеля геном устойчивости к фитофторозу - это целевой ген.
Маркерным геном был ген GFP (green fluorescent protein) - ген флуорисценции, выделенный из медузы, и используемый оооооооочень часто в "маркерных растениях", создаваемые методом изобретенным самой природой х)
ПЦР-анализ. Выделяемая ДНК из растений содержит некоторое количество копий нужного гена. Что бы определить его наличие искуственно заставляют полимеразы синтезировать только этот ген. Полимераза - это фермент, удвояющий ДНК. Что бы начать делать свою работу, ей нужно "куда-то" сесть. В клетке есть специальные "затравки". В пробирке используются праймеры. Для определения наличия какого-либо гена используется 15-20 нуклеотидов с одного и с другого конца гена. Полимераза садится на праймер и делает ген. Его становится больше, больше, больше. Если праймеру некуда сесть (нет целевого гена в пробирке), реакция не идет.
После реакции получившуюся смесь разделяют в агарозном геле просто поместив этот гель в солевой раствор под напряжением. Более короткие кусочки "убегают" дальше от лунки, в которую была залита проба - им легче проникать между молекулами геля. Более длинные - "убегают" короче.
На рисунке "М" - это маркер. Смесь последовательностей известных длинн, с помощью которого можно примерно оценить длину соседних фрагментов.
"С-" - отрицательный контроль, для которого используется растение "дикий тип". (Дикий тип - это изначальное, нетрансформированное растение. Любое, как культурное, так и нет. Дикий вид - "некультурное" растение)
"С+" - положительный контроль, для которого используется плазмида.
Для ПЦР анализа использовались уже отобранные по селективному гену растения, и проверялись на наличие целевого гена. В данном случае у всех растений есть "полоса" нужного размера - значит все имеют встройку гена.
Электрофореграмма результатов Нозерн-гибридизации
Встройка гена не всегда означает его транскрипцию. Возможно, что ген есть, но молчит (молчащих генов в любом организме много, это может быть по многим причинам). Поэтому необходимо проверить его экспрессию.
Для этого выделяют из растений РНК и прогоняют на агарозном геле - левая часть картинки.
После чего к гелю прикладывают мембрану, на мембрану кладут бумажки, а низ геля помещают в раствор, и благодаря силам, которые поднимают воду вверх, смачивая бумаги на мембране РНК переносится с геля на мембрану, которая задерживает ее в себе, не давая уйти на бумажки. После этого радиактивной меткой, которая садится только на РНК целевого гена обрабатывают мембраны, и в итоге получается картинка как справа. Если есть пятно - значит целевой ген экспресируется. В данном случае это справедливо для всех растений. Можно по яркости пятен сравнить где гена экспресируется больше, в где меньше. Но очень приблизительно. (Для оценки количества экспресии генов используется метод ПЦР в реальном времени)
Экстракт пептидов
Когда трансгенные растения выросли, они должны были наработать пептиды, которые помогают им защищаться от фитофтороза и альтернариоза (Самые растространенные грибки, поражающие картофель)
На первой картинке - листья картофеля, растертые в жидком азоте и залитые экстрагирующей смесью.
На второй картинке - получившаяся и уже растаявшая смесь, но отцентрифузированная.
На третьей картинке виден белый осадок - это и есть экстракт пептидов.
фитофтороз
На картинках видно, как зооспоры выходят из зооспорангия (слева), и виден уже развитий мицелий гриба фитофтороза (черные полосы)
Влияние экстрагированного комплекса пептидов на зооспорангии фитофтороза
Как видно, зооспорангии не открывается, и зооспорыне выходят. Заражения грибом не может произойти.
Ну и в последующий опытах было показано, что трансгенные линии лучше дикого типа устойчивы к фитофторозу.
@темы: Работа
